文|贾文彬的史书
编辑|贾文彬的史书
全细胞提取物由1x106 HUVEC镀于6cm的培养皿中，首先从细胞中抽吸培养基，在室温下用PBS洗涤细胞单层两次。
每个孔加入1 ml PBS，随后刮取细胞单层，转移到1.5 ml埃彭多夫管，放置在冰上，80g离心3分钟，使细胞内容物成球。
抽吸上清液，小球在60µl1%的含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的Triton X-100裂解缓冲液中重悬，随后细胞在冰上孵育30分钟，将细胞悬液在4℃下以2100g离心10分钟，使任何核碎片成球。
上清液或细胞提取被转移到一个新的1.5毫升Eppendorf管，和孵化在100℃热块5分钟等体积的2xSDS非还原样品缓冲之前，被凝胶电泳分离或存储在-20℃以后使用。
用凝胶电泳分离蛋白质
SDS聚丙烯酰胺凝胶在凝胶盒中制备，并制备SDS聚丙烯酰胺分解凝胶并倒入平板中，溶解凝胶凝固后，制备SDS聚丙烯酰胺堆叠凝胶，并倒在固定的溶解层上。
此外，在堆叠层中放置了一个12孔的梳子，一旦凝胶凝固，梳子和盒底的磁带一起被移除，并按照制造商的说明放入分离罐。
凝胶分离箱中填充SDS Page非梯度凝胶缓冲液，然后将SDS聚丙烯酰胺凝胶在125V下运行90分钟，或直到凝胶前部到达凝胶底部，通过负载染料中存在溴酚蓝检测。
蛋白质从sds-聚丙烯酰胺凝胶转移到聚偏二氟乙烯固定剂-fl膜上
运行凝胶后将其从盒中取出，丢弃堆积凝胶，然后在西方转移缓冲液中浸泡20分钟，然后组装转移室，将PVDF固定-fl膜在甲醇中预激活或2秒，然后在西方转移缓冲液中浸泡30分钟。
凝胶转移装置和3MM的惠特曼滤纸，一起浸泡在西方转移缓冲液中，为了设置转移，首先将三个印迹垫放置在转移外壳的阳极侧。
在这上面放置一块或之前浸泡过的3毫米的纸，在上面放置PVDF固定-fl膜，然后再放置一张3毫米的纸，此时，一个塑料管被卷在堆叠的凝胶和薄膜上，以去除任何气泡。
再添加三个印迹垫，并将转移外壳的阴极侧放置在顶部，将整个堆栈转移并固定到凝胶转移装置中，然后将凝胶罐充满西方转移缓冲液，设置在30V下运行1小时30分钟。
蛋白质免疫检测
转移后，将膜放在含有5%牛奶的1倍TBST溶液中，在室温下的旋转平台上封闭至少1小时，多余的牛奶被倒出来并丢弃，用1倍的TBST清洗膜一次。
然后将膜与抗体缓冲液与所需的一抗在旋转平台上孵育24小时，一抗孵育后，膜在1倍TBST高盐洗涤缓冲液中洗涤5分钟。
紧接着，在旋转平台上与所需二抗的抗体缓冲液室温孵育2小时后，如前面所述，将膜再清洗5次。
用相关抗体探测膜后，用两个TBS漩涡洗涤膜以去除多余的补间，使用奥德赛红外成像系统，在制造商的指导下，对该膜进行成像。
对于某些实验，如检测加载控制，使用剥离缓冲液剥离膜，简单地说，将膜置于预热过的剥离缓冲液中，在60 C的水浴中放置30分钟。
然后将剥离缓冲液剥离，在1倍TBST高盐洗涤缓冲液中洗涤5分钟，用适当的抗体重新探测。
蛋白印迹法的定量分析
在扫描膜后，使用奥德赛软件分析了条带的密度，简单地说，背景方法的选择是通过使用绘图面板来选择一个能够良好地代表背景的印迹区域。
然后在感兴趣的波段周围绘制矩形盒子，并记录相对的波段强度，将感兴趣的蛋白质与加载对照组进行了比较。
基于细胞的裂解试验
为了评估adam10依赖的ve-钙粘蛋白脱落的影响，我们采用了基于切割的检测方法，在本实验中，HUVECs在完全的HUVEC生长培养基中培养，在0.1%明胶涂层的6厘米培养皿中培养。
ADAM10的活性通过使用ADAM10优先抑制剂，或使用siRNA沉默ADAM10基因来靶向。
对于ADAM10抑制剂裂解试验，HUVECs生长至融合，然后用0.02% DMSO或20µM GI254023X和10µM的γ-分泌酶抑制剂、DAPT在37 C和5%二氧化碳下处理24小时。
在ADAM10 siRNA敲除实验中，HUVECs用2个siRNA双链中的一个转染，在获得ADAM10敲除HUVECS的24小时前，加入10µM的DAPT，以防止ve-钙粘蛋白c端片段的进一步处理。
然后收集HUVECs，结果在奥德赛红外成像系统上进行了成像和量化，为了在脱落试验中定量蛋白质条带，在已知的蛋白质全长和切割片段周围绘制条带。
通过将切割带强度与全长带强度相加，计算切割蛋白的百分比，得到总蛋白带强度值，然后将剪切带强度除以总蛋白带强度值，再乘以100得到剪切百分比值。
实时定量PCR（qPCR）分析蛋白敲除
从1x106个HUVECs中提取总RNA，简单地说，HUVECs通过胰蛋白酶/EDTA溶液解离并离心，如第2.2.3节所述进行离心，离心后，用PBS洗涤小球两次，以去除多余的培养基。
根据制造商的说明，使用RNeasy迷你试剂盒直接从细胞颗粒中分离RNA，最初，在RNA分离之前，细胞通过QIA碎纸机将细胞均质化。
用NanoDrop检测分离出的RNA的总收率，并调整到1µg/µl，然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒，将其逆转录到单链cDNA上。
将10X逆转录缓冲液与25X dNTP mix、10X逆转录酶随机引物和MultiScribeTM逆转录酶与RNA结合，最终体积为20µl。
反应在以下条件下在热循环器中孵育：25℃10分钟，37℃120分钟，然后85℃步骤5分钟。
实时PCR采用Taqman®基因表达分析，使用ABI Prism 7000系统，采用GAPDH、Tspan5、Tspan10、Tspan14、Tspan15、T17、Tspan33的Taqman引物。
20µl反应混合物，包含10µl 2x塔克曼®主混合，1µl所需基因塔克曼®FAM-TAMRA水解探测器，以及50微克cDNA放大使用以下热循环参数。
一个周期50℃2分钟之后，是一个周期在95℃10分钟，之前44周期95℃15秒变性和44周期60 ℃退火和扩展。
数据使用ABI PRISM 7000 SDS软件进行分析，一种方法用于计算用于评估敲除效率的PCR反应中的总mRNA水平，Ct表示阈值线在反应的指数阶段与放大曲线相交的点。
在最初设置一个基线，以在反应的初始阶段消除任何背景非特异性噪声，手动调整阈值，使其跨越每个实验中所有PCR反应的指数阶段。
由此可见，我们可以注意到Ct值，将TspanC8s的Ct值与管家基因GAPDH的CT值进行比较，从这些ΔΔCt值中被记录下来，并表示为相对mRNA的表达量。
静态粘附分析
静态粘附试验被用来评估PBL或单核细胞的迁移，因为与流动粘附试验相比，它是一种更高通量的方法，HUVECs被镀入12孔板中，用促炎细胞因子处理。
在进行粘附试验之前，微孔上的加热器被打开并设置为37 ℃，在这些粘附试验中，使用M199+BSA缓冲液作为洗涤缓冲液。
用1 ml M199+BSA冲洗HUVEC单层两次，以去除任何残留的细胞因子/抑制剂，将1 ml新鲜分离的PBLs加入到HUVEC单分子层中，将12孔板置入37℃和5%二氧化碳的培养箱中7分钟。
这段时间已被证明足以显示足够数量的转运PBLs或单核细胞，孵育后，抽吸细胞悬液，随后用1 ml M199+BSA洗两次，冲洗HUVEC单层。
然后在室温下用2%多聚甲醛固定HUVEC单分子层5分钟，去除多余的多聚甲醛，再用PBS洗涤孔两次，在孔中保留1 ml PBS，用相衬显微镜对HUVEC单层进行成像。
白细胞行为的定量分析
对于流动粘附试验，使用ImagePro分析软件，使用分析过程中捕获的视频来分析白细胞的招募和行为。
分析白细胞灌注后2分钟后的10秒记录的白细胞行为，计算在整个10秒的记录中出现的白细胞数量，从这个值可以计算出每个场粘附的中性粒细胞的平均数量。
为了计算总粘附力，通过测量单个帧的长度和宽度来计算单个场的面积，将其乘以计数的白细胞平均值，再乘以灌注的白细胞数量，得到对应总粘附值。
白细胞根据三种不同的行为进行分类：白细胞要么滚动、牢固粘附，要么被转移。
一个滚动的白细胞被归类为一个沿着HUVEC单层移动非常缓慢的相亮细胞。
一个牢固粘附的白细胞是一个结合在HUVEC单层表面的相亮细胞，要么在视频期间不移动，要么显示出在HUVEC单层上经历了形状变化和迁移特性的证据。
一个转移的白细胞被归类为一个细胞形态改变，并迁移到HUVEC单层下的细胞，计算了表现出不同行为的白细胞的百分比。
对于白细胞速度的计算，白细胞的滚动速度是通过测量一个被跟踪的白细胞在10秒内的移动距离来计算的。
距离通过除以视频持续时间转换为µm/秒， 使用5分钟的速度记录，计算表面粘附（相亮）和迁移（相暗）白细胞的速度。
为了做到这一点，在序列开始时，我们在迁移的白细胞周围画了一个轮廓，并在整个视频录制过程中跟踪它们的运动。
每个跟踪的白细胞每30秒间隔记录质心的X和Y坐标，将毕达哥拉斯定理应用于X和Y值，计算µm/min的旅行距离。
追踪至少10个迁移的白细胞，并用于计算牢固粘附的白细胞或迁移的白细胞的平均速度。对于静态粘附分析，白细胞被分为牢固粘附。
在最后的清洗阶段后，立即制作HUVEC单分子层的数字图像，取5个随机视野的图像来计数贴壁细胞。
由于HUVEC单分子层使用2%多聚甲醛固定，速度数据不能从静态粘附试验中计算出来。进行总细胞计数，结果以各自的白细胞行为的百分比表示，总粘附值的计算方法与流动粘附试验条件下的总粘附值相似。
总结
所有数据分析均采用GraphPadPrism®5软件进行，数据以均值的±标准误差表示，两组之间的差异使用学生t检验进行分析。
为了分析多组之间的差异，使用了单向或双向方差分析，然后采用Dunnett事后或Bonferroni多重比较事后检验。
百分比数据在统计分析前进行正弦变换以正态分布，P值<为0.05，视为差异有统计学意义。
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