㈠ 做紫外吸收光谱时,为啥会随着所测物质的颜色越深吸收值越大
吸光度,浓度越大,吸光度越高,但也有可能浓度越大你的溶液颜色也越深,这根具体侧的物质有关。
紫外光谱是紫外分光厅樱旅光度计等分析化学中的重要工具。UV(紫外线)光谱的另一个名称是电子光谱,因为它涉及将电子从基态提升到更高的能量或激发态。
从比尔-朗伯定律可以清楚地看出,能够吸收给定波长的光颂乱的分子数量越多扮凳,光吸收的程度就越大。这是紫外光谱的基本原理。
㈡ 高效液相色谱法测定维生素c的含量为什么用棕色瓶容量瓶
1.滴定法测定维生素C
1.1测定原理
2,6一二氯靛酚法和碘量法是较常见的滴定测定维生素C的方法。还原型抗坏血酸还原染料2,6一二氯靛酚,该染料在酸性中呈红色,被还原后红色消失。还原型抗坏血酸还原2,6一二氯靛酚后,本身被氧化成脱氢抗坏血酸。在没有杂质干扰时,一定量的样品提取液还原标准2, 6-二氯靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。
碘量法的原理:维生素C包括氧化型、还原型和二酮古乐糖酸三种,当用碘滴定维生素C时,所滴定的碘被维生素C还原为碘离子,随着滴定过程中维生素C全被氧化,所滴入的碘将以碘分子形式出现。碘分子可以使含指示剂(淀粉)的溶液产生蓝色,即为滴定终点。
1.2测定操作
2,6一二氯靛酚法:取适量的样品可食部,加入100 mL 2%草酸溶液,制成匀浆。取同一样品匀浆10g,加入1%草酸溶液20 mL,摇匀,用滤纸过滤,取5mL过滤液于锥形瓶中,用2,6一二氯靛酚钠盐溶液滴定(1 mL≈0.02 mgVitC),以淡红色存在30 s内不褪色为滴定终点。记录2,6-二氯酚靛酚钠盐溶液的消耗量,根据结果计算出样品中维生素C含量(mg/100 g)。
碘量法:将果蔬洗净,用纱布拭干其外部所附着的水分,若样品清洁可以不必洗。样品可以先纵切为4~8等份,分别称取20g可是用食部分,置于研钵中加入2% Hcl 15~10ml,研磨至浆状,移于 100ml 容量瓶中,用2% HCl 加至刻度线处,混匀,过滤,记录滤液总体积。样品液的测定: 在50ml 烧杯中,用移液管注入10% KI 溶液0.5ml,0.5% 的淀粉溶液 2ml,样品液 5ml,蒸馏水 2.5ml,用0.001N KIO3 液滴定,要一滴滴加入,并时时摇动烧杯,至微蓝色不褪色为终点( 一分钟不褪为止) 。记录所用 KIO3 液毫升数,计算维生素C含量。
1.3测定方法评价
2,6-二氯酚靛酚滴定法具有简便、快速、比较准确等优点,适用于许多不同类型样品的分析。缺点是不能直接测定样品中的脱氢抗坏血酸及结合抗坏血酸的含量,易受其他还原物质的干扰,如果样品中含有色素类物质,将给滴定终点的观察造成困难。碘酸钾滴定法较便宜,使用碘酸钾滴定法测定蔬菜中维生素C含量较为简便易行,而2,6一二氯靛酚法相对复杂。总的来说,滴定法操作简便、快速,无须特殊仪器,但在测定深色样品时,准确度和精确度欠佳。
2.荧光法测定维生素C
2.1测定原理
Deutsch和Weeks曾经报道过一种检测维生素C的荧光分析法(OPDA),并被指定为维生素C的经典荧光分析法。在该方法中,维生素C先被活性炭(Norit)氧化为脱氢抗坏血酸(DHAA),DHAA再与荧光底物邻苯二胺(OPDA)结合生成荧光产物,通过对该荧光产物的检测实现对维生素C的定量分析。孙振艳等[1]提出了一种新的测定维生素C的荧光分析方法。基于维生素C被Cu2+氧化为DHAA,DHAA进一步与苯甲酸及十六烷基三甲基溴化铵产生荧光协同增敏作用,通过对体系荧光强度的测定进行维生素C的定量分析。
2.2测定操作
荧光分析法(OPDA)的测定方法:称取一定量样品,研磨后用水浸泡,取清液加入适量1%草酸溶液,振摇约3min,加入0.2g已处理好的活性炭再充分振摇约3min后过滤,滤液加于两个25mL比色管再加入5.0mL缓冲溶液,,其中一管加入2.0mL硼酸溶液(即空白)摇匀,放置15min后,两管均加入邻苯二胺溶液10mL,避光放置30min待测。样品荧光强度减去空白荧光强度值即为样品相对荧光强度值。
孙振艳等的荧光分析法:在25 mL比色管中依次加入0. 6 mL CuSO4溶液,2. 0 mL十六烷基三甲基溴化铵溶液,2. 0 mL苯甲酸溶液,一定体积的维生素C标准溶液,,5. 0 mLNaOH-邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液,用蒸馏水定容,摇匀。在35℃恒温水浴中加热30 min,将溶液流水冷却至室温,激发波长为308 nm,在发射波长408nm处,测量荧光强度F,以不含维生素C的试剂空白为F0,计算ΔF=F-F。
2.3测定方法评价
荧光分析法测定维生素C具有操作简单,精密度高,检出限低等优点,该法可以应用于水果、蔬菜和药物中维生素C的检测,适于推广。
3.光度分析法测定维生素C
3. 1测定原理
2,4-二硝基苯肼法和钼蓝比色法是常见测定维生素C的一种光度分析法。2,4-二硝基苯肼法的原理是总维生素C包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸,样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸,再与2,4-二硝基苯肼作用生成红色脎,脎的含量与总抗坏血酸含量成正比,进行比色测定。钼蓝比色法是测定果蔬中还原型维生素C含量的一种常用方法,因偏磷酸和钼酸铵反应生成的磷钼酸铵经还原型的维生素C还原后生成亮蓝色的络合物,通过分光比色可以测定样品中还原型维生素C的含量。
3.2测定操作
2,4-二硝基苯肼法:取适量的样品可食部,加入100 mL 2%草酸溶液,制成匀浆。取匀浆20 g (含1~2 mg抗坏血酸)置入100 mL容量瓶中,用1%草酸溶液定容,混匀后过滤。取25 mL过滤液放入有2 g活性炭的25 mL比色管中,振摇1 min,过滤。然后取10 mL此氧化提取液,加入10 mL 2%硫脲溶液,混匀。按照GB12392-90中呈色反应方法,用分光光度计进行比色,根据结果计算出样品中抗坏血酸含量。按下式计算样品中Vc的含量:X=c·Vm×F×1001000。
X—样品中总抗坏血酸含量,mg/100g;
c—由标准曲线查得或回归方程算得“样品氧化液”总抗坏血酸的浓度,μg/mL; V—试样用1%草酸溶液定容的体积,mL; F—样品氧化处理过程中稀释倍数; m—试样质量,g。
钼蓝比色法:准确称取 100 g 样品, 加入草酸-EDTA 溶液, 经捣碎后移入 100 mL 容量瓶,定容,过滤,吸取 2 mL 上清液于 50 mL 容量瓶中,加入 1 mL 的偏磷酸-醋酸溶液,5%的硫酸 2.0 mL,摇匀,加入 4 mL 钼酸铵,以去离子水定容至 50 mL,20 min 后测定吸光度。
3.3测定方法评价
钼蓝比色法测定果蔬中还原型维生素C含量数据稳定性、准确性较好,是一种快速、准确、灵敏度高的测定方法,而且不受样液颜色的影响。2,4-二硝基苯肼比色法测定总VitC (还原型和氧化型),特异性较好,但操作复杂,是我国食品中VitC测定的标准方法,此方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。
4.高效液相色谱法
4.1测定原理
高效液相色谱法是近年来发展起来的一种测定维生素 C 含量的方法,测定维生素 C 含量通常采用 C18柱或 C8柱,由于维生素 C 对紫外光有吸收,故检测器常用紫外检测器。
4.2测定操作
称取维生素C标准样品0.1000 g.转移至100 ml容量瓶中,用双蒸水定容,得到1.0mg·ml-1的维生素C标准溶液。参考Nisperos-Carriedo等的方法。准确称取果肉1.00 g,用5 ml 0.2%偏磷酸冰浴研磨, 10000 g离心15 min,残渣加入4 ml 0.2%偏磷酸再提取,合并上清液,定容至10 ml,经0.45μm滤膜过滤后待测。每个样品重复5次。维生素C在240 nm波长时有最大吸收峰,故以240 nm作为检测波长。以0.2%偏磷酸为流动相。分别吸取标准溶液1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8m,l各自定容至10 m,l从中分别吸取10.0μl进样分析,以峰面积(mv)为纵坐标,标样浓度(mg·ml-1)为横坐标,绘制标准溶液曲线,计算线性回归方程的回归系数和截距。将样品溶液分别进样10.0μl进行液相色谱分析,测定维生素C的色谱峰面积,代入标准曲线计算出维生素C含量。
4.3测定方法评价
高效液相色谱法具有高效、快速、稳定、结构准确、操作简便等特点。该法分离时间短,对结构不稳定的维生素C尤为适合,还特别适用于颜色较深的提取液样品的测定,成为近年来较受欢迎的维生素C测定方法。缺点是所用仪器较为昂贵。
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