出品：科技《科学大家》、未来论坛
主讲嘉宾：王健伟，中国医学科学院-北京协和医学院副院校长
经过一整年严格的新冠疫情防控，时间再次带着我们进入严冬，全国多个城市又出现了小范围疫情。与去年此时不同的是，我们已经掌握了更多的防控信息和技术，也有了一套较为成熟的应对方案，包括北京、大连、沈阳等城市在内，各地均能够在发现疫情后短时间内完成流调排查，为数千万市民进行病毒核酸检测。
新型冠状病毒的全球大流行是很多人第一次亲身经历重大疫情。其实自人类文明诞生以来，传染病就如影随形，和人类相伴。人类历史上数次爆发重大疫情，瘟疫造成的死亡数量堪比战争。传染病不仅危害人类的健康，还对政治、经济、社会、军事产生重要的影响。从希腊文明的陨落到基督教的兴起，从阿兹特克帝国的衰亡到第一次世界大战的终战，其间都有传染病的身影。
尽管随着现代医学的发展，传染病的发病率和病死率有了显著的下降，但仍然是人类的重大挑战。比尔盖茨在2015年的一次演讲时说道：“在未来几十年，如果说有什么东西能够杀死上千万人，最有可能是一种高度传染性的病毒。”鉴于此，世界卫生组织号召全世界加强对传染病的研究，以应对可能出现的暴发流行。严格准确的病原检测技术，正是重要的应对手段之一。检测技术如何帮助防疫人员们变身“福尔摩斯”？病毒溯源的过程又是什么样的？
未雨绸缪的前瞻性研究
从2015年开始，世界卫生组织每年都列出号召全球优先研究的传染病清单。从2018年开始，“X疾病”一次开始出现在这份清单中。“X疾病”代表一种未知病原体造成的严重的流行病，可以是自然发生的，也可以是人为故意的，有可能在任何的时间，由多种来源触发，或许会夺去数百万人的生命。这种“X疾病”代表了未来的一种可能——可能是一种未知的传染病。
目前，已经知道的病毒有很多。据科学家估计，在哺乳动物和鸟类当中有100多万种病毒，而其中至少有60万种以上可以感染人类。但目前已知可感染人类的病毒还不到300种，“尽管大家知道病毒是潜在的威胁，但依然无法预测下一种新的病毒在何时何地出现，或者来自哪一种物种。”因此，加强病原检测鉴定技术以及药物疫苗的研究，是应对未来可能出现的新发突发传染病挑战的一项重要举措，这其中病原检测技术又首当其冲。
目前病原的检测技术面临着众多的挑战。一是病原的种类非常多。目前可以引起传染病的病原包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等很多种类。二是病原体的变异非常频繁，可以通过突变来逃逸免疫，引起新的流行，也可以逃避原有疫苗的作用。动物来源的病原识别也比较困难。三是可能存在着多种病原体共感染的现象，为病原的鉴定带来了困难。此外，临床样本中病原的含量可能比较低，检测也比较困难。
近百年以来，随着微生物学的发展，对病原体的检测已经建立了多种方法。以病毒检测为例，我们可以检测分离的整体病毒颗粒，也可以对其抗原成份进行检测，还可以检测病毒感染人体产生的抗体，对病毒的感染进行诊断。另外，随着分子生物学技术的兴起，核酸检测成为代表性的技术方法。这些技术的用途比较广泛，但是还存在一些不足。比如病毒颗粒分离培养的方法，它的技术难度比较大、比较耗时，检出率低，难以普及。抗原抗体的检测方法容易受到干扰，抗体的检测存在窗口期的问题，抗原的检测存在灵敏度的问题。
核酸检测是目前应用比较广泛的，最具代表性的是PCR方法。这种方法通过对一个病毒的基因片段进行上亿次的扩增，使痕量的病毒核酸得以检测，所以在临床上得到了比较多的应用。但PCR的方法受制于对病毒序列的依赖，即必须先要知道病毒的基因序列才能设计出PCR的检测方法。
“一锤定音”：宏基因组测序技术
近年来，高通量的宏基因组测序技术逐渐得到了应用，并且发挥了重要的作用，特别是在病原体的诊断当中，发挥“一锤定音”的作用。宏基因组技术用于病原体的检测有很多的优势。一是和PCR这些序列依赖的方法相比，它是非序列依赖性的，所以不需要预知任何病原体序列信息就可以进行检测。二是病原体检测的灵敏度比较高。三是检测的通量高，可以同时检测上万种病原微生物的物种，也可以发现可能的共感染。四是检测效能高，通过一次测序就可以拼接出病原体的基因组序列，不需要再重复进行实验。五是解析的深度深，可以同时分析病原体的变异和耐药等情况。最后，它获取的信息全，除了获取病原的序列之外，还可以同时获取宿主的基因组和转录组的信息，为预警和临床诊疗提供基础。
宏基因组的病原体检测技术在近十几年以来，在新病原的发现当中发挥了重要的作用。首先就是新冠病毒的发现和确症。2019年12月，武汉出现了不明原因的肺炎。由于偶然的机会，我们的合作伙伴对来自武汉的一例不明原因肺炎的肺泡灌洗液的样本进行了深入的测序，对这个数据分析后我们发现里面存在着一种新的冠状病毒，并且拼接出了它的全基因组序列。这个序列显示，它和既有的SARS病毒和MERS病毒（中东呼吸综合症冠状病毒），序列是完全不同的。这说明存在一种全新的冠状病毒，可能和出现的肺炎病例有关系。
接下来要做的是确证是不是这一新的冠状病毒引起了这些肺炎的病例。所以我们从病人身上收集了更多肺泡灌洗液、咽拭子、痰液等样本，把呼吸道样本进行前处理，提取核酸之后来建立测序文库。对样本上机测序之后进行生物信息学的分析，首先去除人类基因组的污染，把剩余的序列和公开的数据进行比对，鉴别里面存在的微生物的物种，从而确定病原。
但是对于新病原的鉴定来讲，光靠测序还不够，还需要用其他的方法进行鉴定。我们首先对5例样本进行检测。可以看到，5个病例的呼吸道样本当中都可以检测出一种新的冠状病毒的基因。对它进行基因谱系的分析，就像画家谱一样的，和其他已经知道的冠状病毒去比较发现，发现这个冠状病毒是一个全新的病毒。而且我们也推测，它和SRAS病毒相似，也可能使用ACE2作为受体。
在这个基础上，我们很快分离出了病毒，通过电子显微镜可以看出，它是典型的冠状病毒的形态，上面有像皇冠一样的特征性结构。另外，我们也做了免疫学的实验。因为病人感染病毒之后会产生抗体，我们利用这些抗体与分离的病毒做免疫荧光可以看到阳性的信号。所以结合我们的宏基因组的分析、PCR的检测、病毒的分离、免疫荧光的鉴定等等，提示这是一种新的冠状病毒，引起了不明原因的肺炎。
因为有了这样的方法，我们和曹彬教授、黄朝林教授等合作，很快对早期的病例进行诊断，使我们能够很快报道这些病例的临床特征，而且也对这些病例的来源进行了追溯，为疫情的预警和临床诊疗方案的制定提供了重要的基础。我们也通过GISAID的平台，代表国家最早向全球共享了病毒全基因组的序列。病原鉴定工作得到了世界卫生组织的高度评价，谭德赛总干事指出：“中国在创记录的时间内识别出病原体，并立即进行分享，为迅速研发诊断工具作出了贡献。”
在这个基础上，我们也研发了病毒核酸的检测方法，向全国推广应用。2020年1月11日，这一方法在武汉现场通过了国家卫生健康委科教司组织的验证，之后获得了产品证书。
另外，针对PCR检测方法对咽拭子检出率不到50%的情况，我们也提出结合IgM抗体的检测，可以大幅提升病毒感染的诊断率，我们也获得了两项诊断产品的证书。
准确追踪疫情的重要工具
在去年三四月后全国的疫情逐渐归于稳定平静。北京在6月10日之前已经有连续56天没有本地新发的新冠肺炎病例。6月11日却突然发现一个病例，引出了新一波小范围疫情。这次疫情通过全市的筛查和防控措施的实施等一系列的努力，到8月初被成功终止，有力地维护了首都的安全。但是在疫情应对的过程中，有这样几个为题需要准确回答：疫情是什么时候发生的，是从哪儿来的，源头在哪里，是怎么传播的等等，这样才能为此后防控提供有效的指导。
6月11日的病例发现以后，通过对患者轨迹的追溯，北京有关部门对他的密切接触者和接触的环境样本进行了检测。由此发现了两份来自新发地农贸市场的样本是新冠病毒的核酸检测阳性。在这个基础上，对新发地进行了扩大检测，在538份样本当中检测出45份是阳性。这说明新发地是疫情发生过程中的重点场所。因此，北京市有关部门在6月13日果断的关闭了新发地市场。市场关闭以后，在全市采取了严格的管控措施，病例的数量迅速下降，到7月初，基本上没有新发的病例，疫情得到了有效的控制。
新发地是北京最大的农贸市场，有超过5千以上的摊位，每天的客流量有5万以上，所以它的疫情备受重视。北京市有关部门对新发地的员工进行了筛查，发现在3300多位员工当中有169位是新冠病毒核酸阳性。
与此同时，流调结果显示，在关闭市场之前，从5月底到关闭市场之前的10多天中，有55万顾客到访过新发地。通过对他们的追踪，发现有103例是新冠病毒阳性。在这个基础上，对全市1000万人进行了筛查，发现96人是阳性。截止到7月10日，总共发现了368名感染者，距离6月11日发现病例刚好过去了一个月的时间。
确定感染路径之后就有这么几个问题需要解答。首先，病毒是什么时候进入新发地市场的？我们将所有的病例做了一个时间的分布。由于新冠病毒感染的潜伏期一般在14天以内，所以从6月初的病例往前推，应该病毒是在5月底侵入到了市场中。不论是员工、顾客，还是没有市场接触史的感染者，他们基本上都和新发地有直接或间接的关系，所以新发地是这次疫情唯一的来源。
确定了新发地是疫情的来源，那么它的源头又在哪里？北京市有关部门对新发地内环境样本和从业人员进行了检测，包括交易大厅的负一层，检测了584个人，其中有122人是阳性，阳性率高达20.9%。市场上的其他厅检测了2727人，47人阳性，阳性率只有1.7%。所以交易大厅引起了高度的关注。交易大厅分为海鲜区、展柜区、豆制品区和牛羊肉区，其中海鲜区的检出率最高，高达50%以上。
摊位的环境样本和人员样本的监测结果还显示，有14个摊位的工作人员和环境样本都是阳性的。因为北京当时没有疫情传入，而且在这之前也没有发现感染者，所以病毒极有可能是从新发地的环境当中来的，所以这14个摊位被列为重点研究对象。对5月下旬到6月12日之前到访的这14个摊位的3200多名顾客进行了抗体的检测后，我们发现有5位顾客的抗体是阳性的，而恰好这5位顾客在5月30日和31日都到访过S14这个摊位，而且这5个人和他的密切接触者，在14天内都没有到访过其他的中高风险地区，也没有接触过来自中高风险地区的人员，基本可以排除是外来的感染。
在此基础上，对这些病例到访的摊位进行了研究，显示S14摊位感染的比例是最高的，7个员工全部都感染了，而且抗体的阳性率也是最高的。另外，从发病的时间来看，他们的发病时间在发病的感染者当中也是比较早的。这个摊位的所有工作人员14天以内都没有到访过其他的中高风险地区，也没有接触过来自中高风险地区的人员。据此可以判断，S14摊位很可能就是感染的源头。
形成检测技术体系，更快更便宜更智能
锁定了S14摊位，且可能是环境样本造成暴露，那么病毒又是从哪儿来的呢？结合流行病学和测序技术的基因组流行病学，是追踪传染的来源的一个非常有用的工具。但在环境样本中，病毒的含量是特别低的，样本量又非常大，通过高通量测序有一定困难。在北京大学谢晓亮教授的支持下，清华大学王建教授的团队开发了一种基于SHERRY的Minerva技术。通过这个技术可以把文库构建的速度缩短到5个小时以内，测序的速度更加快捷；另外，还能建立了基因组富集的方法，使载量很低的样本能够得到有效测序。
基于这样一个技术体系，我们通过合作，对110份新冠病毒阳性的感染者和环境样本进行了病毒基因组测序，得到了72条高质量的全基因组序列，包括56条感染者的基因组序列和16条环境样本的基因组序列。通过这样的方法我们也得到了环境样本的全序列。对这个序列进行分析发现，每一条序列上都有8个突变的位点，有53%的序列只有这8个突变，其余的序列还有其他一些突变。这就说明这些突变是单一的来源，从病毒基因组的层面也证明新发地的感染是单一来源的。
这个过程是对病毒进化树分析的前提，之后的工作就像我们排家谱一样，看看那些病毒系列的相似度更高。新发地发生疫情时，在吉林和黑龙江也有疫情，比对后我们发现，来自北京新发地的病毒序列和2020年3月前在京流行的毒株、彼时在黑龙江和吉林流行的毒株都不一样，却和在国外，特别是在欧洲等地流行的毒株突变位点是相同的。这就说明这个毒株来自于境外。
那么怎么从境外传进来的呢？除了S14摊位，市场只有一个摊位也是售卖三文鱼的，这个摊位没有病例，而S14摊位是自己在市场内切割，其员工全部感染。且S14所卖的商品中只有三文鱼是从境外进口的。
为了进一步追溯感染的来源，我们对三文鱼进行了检测。S14在5月30日曾经购入了一家公司从境外进口的三文鱼，但由于这批三文鱼已经卖完，所以很遗憾，我们未能得到鱼的样本。但是我们从一份没有开封的鱼体表面，通过测序得到了覆盖55%的基因组序列。通过比对发现这个序列，和我们前面在新发地测得的流行毒株的序列是一致的，也有这些相同的基因突变的位点。所以这就提示，尽管我们因为样本原因没有分离到这个病毒，无法证明它的感染性，但是可以提示进口的冷链食品可能是病毒的传播载体。这也是第一次提出了这样的一个发现。
而市场内所有的三文鱼的供应商仓库的3000多份三文鱼经过检测后，有6份结果是阳性，而其中5份是来自X公司。随后在国内多个地区也都发现在冷链食品表面检测出新冠病毒核酸，并且中国疾控中心在青岛在冷链食品的表面分离出新冠病毒。所以这也从另一个方面提示冷链食品在新冠病毒传播中的重要性。
通过疫情初期和北京这次小范围疫情就能看出，基于宏基因组检测技术对于病原的发现和溯源以及追踪具有非常重要的作用。所以，未来要针对临床和疾控的需求，使测序的速度更快、成本更低，通过自动化、智能化的技术，使它的使用更加便捷，而且能够适应变异和耐药分析等多样化功能的需求，从而能实现走向普及应用，为随时应对可能发生的疫情提供有力的支撑。
注：本文根据王建伟教授在未来科学大奖周演讲内容整理而来，有删改。
