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前言
目前，使用嵌合抗原受体（CAR）T细胞进行治疗已成为治疗某些血液系统肿瘤患者的有力工具。然而，所有FDA批准的CAR－T细胞疗法均基于从患者身上分离的自体T细胞，尽管有显著的临床效果，该策略仍有几个重要的局限性，即治疗成本非常高，个别生产过程可能存在问题。
与使用自体CAR－T细胞的治疗相比，由同种异体供体材料产生的CAR－T细胞具有三个主要优势。首先，根据个体患者的既定治疗方案，可以提前生产同种异体CAR－T细胞，并毫不延迟地交付。其次，异基因供体来源的T细胞不会暴露于多轮抗白血病治疗中，因此它们更容易接受体外操作。第三，一小部分患者最终可能永远无法获得质量良好、数量有治疗意义的自体CAR－T细胞产品。
目前，已有多项异基因CAR－T细胞疗法进入临床阶段，其中一些临床试验展现出良好的应用前景，可能为更多更广泛的患者带来福音。
异基因CAR－T细胞的制造
同种异体CAR－T细胞可以并且应该代替自体CAR－T细胞或与自体CAR－T细胞结合使用时，有几种情况：i）有阻碍自体产品制造的物流问题；ii）制造失败，其中同种异体产品可以替代自体产品，而不会延迟计划的输注；iii）当自体产品在患者体内无法扩增时，输注同种异体CAR－T细胞产品；iv）由于患者的T细胞数量较低和／或疾病进展迅速，无法预先制造自体CAR－T细胞产品；v） 异基因CAR－T细胞产品通过设计成为造血干细胞移植的桥梁。
尽管使用同种异体CAR－T细胞进行治疗有许多优点，但这种技术有两个主要缺点。首先，受者的细胞对所给予CAR－T细胞的天然T细胞受体（TCR）可能诱导其激活并导致急性移植物抗宿主病（GvHD）。其次，CAR－T细胞对宿主免疫系统是外来的，这可能会导致它们迅速从循环中清除。
因此，异基因CAR－T细胞的制造主要是通过各种手段破坏CAR－T细胞的TCR和MHC－1分子。破坏TCR可以通过三种不同的方式进行：抑制蛋白的表达；通过使用TALENS或CRISPR／Cas9敲除编码TCR链的基因；通过shRNA介导mRNA的沉默。
上面的方法均不能从细胞群中100％的去除TCR。因此，剩余TCR＋细胞的额外消耗是制造同种异体CAR－T细胞的一个重要部分，这在很大程度上决定了GvHD的发生和治疗效果。最先进的消除TCR ＋细胞的方法是基于CliniMACS?的装置。简言之，在引入CAR和TCR消除后，首先用生物素化的抗TCR抗体孵育T细胞，然后用与磁性微球结合的抗生物素抗体孵育T细胞。随后，残留的TCR＋细胞被CliniMACS清除。
此外，为了增加异基因CAR－T细胞的持久性，可以考虑通过基因敲除免疫排斥的关键介质MHC－I分子，这可以通过破坏编码β－微球蛋白的基因来实现。
异基因CAR细胞的来源
根据临床经验，同种异体CAR－T细胞清除肿瘤细胞的能力取决于初始扩增、持续时间、GvHD的发生以及宿主免疫系统排斥这些细胞的能力。在制定管理异基因CAR－T细胞的策略时，可以选择不同来源的细胞及细胞亚群。
αβT细胞
用于制造同种异体CAR－T细胞的T细胞主要来源于外周血单个核细胞，尤其是具有由α和β链组成的TCR的细胞，其构成健康供体循环T细胞的约90％。由于αβT细胞在外周血中的相对丰度和快速增殖的能力，它是制造同种异体CAR－T细胞的一个有吸引力的靶点。然而，该细胞亚群在急性和慢性GvHD的发病机制中起主要作用。因此，需要通过基因编辑手段破坏TCR，以减少发生GvHD的风险。
病毒特异性T细胞
除了基因编辑方法外，减轻GvHD的策略之一是使用基于病毒特异性T细胞的CAR－T细胞，这些细胞结合了CAR的抗肿瘤活性和降低GvHD风险。GvHD风险与TCR多样性相对应，因此，输注病毒特异性记忆T细胞后GvHD减少可能是由于病毒特异性记忆T细胞中TCR的功能受到限制。此外，这种策略的一个可能的不足是初始病毒特异性记忆T细胞的数量较低。
γδT细胞
供体来源的γδT细胞通过利用其固有受体以不依赖于MHC分子的方式识别多种肿瘤抗原，并且可以在没有TCR清除的同种异体环境中应用。此外，一旦激活，它们可以通过促进其他免疫细胞的功能，进而产生进一步的适应性免疫反应。
诱导多能干细胞（iPSC）
诱导多能干细胞应用于CAR－T具有显著的优势：iPSC具有自我更新能力，能够在体外长期培养，可以在体外进行各种复杂和精确的基因改造；iPSC具有分化为人体所有细胞类型的能力，可产生大量的功能性T细胞。尽管存在一些限制，但IPSC仍具有均匀和大规模生产的CAR－T细胞的潜力。
NK细胞
异基因NK细胞对于过继性细胞治疗（ACT）是相当安全的，因为它们通常不介导发生GVHD。此外，NK细胞仅分泌少量IFN－γ和GM－CSF，不产生启动CRS的IL－1和IL－6。其次，除了通过单链抗体识别肿瘤表面抗原来抑制癌细胞外，NK细胞还可以通过多种受体识别各种配体来抑制癌细胞，例如自然细胞毒性受体（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM－1（CD226）。最后，NK细胞在临床样本中非常丰富，可以从外周血（PB）、脐带血（UCB）、人类胚胎干细胞（HESC）、iPSC甚至NK－92细胞系中产生。
异基因CAR细胞治疗的临床试验
ALLO－715抗BCMACAR－T细胞（NCT04093596）
这是一项1期临床试验，招募患有r／r多发性骨髓瘤患者。截至2020年10月，共有31名患者纳入安全人群。疗效人群包括26名患者，分为四个剂量水平的细胞（40、160、320和480×106），平均随访时间为3．2个月。
ALLO－715的CAR－T细胞受体包括具有4－1BB共刺激结构域的单链可变抗BCMA片段。为了防止移植物排斥反应，并在不影响ALLO－715 CAR－T细胞的情况下允许选择性淋巴细胞耗竭，引入了CD52和TRAC的KOs。
26名患者的所有剂量组和淋巴清除方案的总有效率（ORR）为42％（11／26）。在接受320×106细胞ALLO－715治疗的10名患者中观察到了优越的抗癌活性。对于该队列，ORR为60％（6／10），其中4名患者（40％）观察到非常好的部分响应。
在45％（14／31）患者中报告了CRS。一名患者在ALLO－715输注后一天出现非中性粒细胞减少性发热和多灶性肺炎，一次5级发作导致呼吸衰竭和死亡。研究认为这一事件与进行性骨髓瘤以及环磷酰胺和ALLO－647预处理方案有关。研究报告，42％（13／31）患者在治疗期间出现了感染性疾病，其中13％的患者出现了3级感染。未观察到GvHD或ICAN病例。
ALLO－501抗CD19CAR－T细胞（NCT03939026）
ALLO－501是一项针对复发／难治性非霍奇金淋巴瘤（r／r NHL）患者的I期临床试验，ALLO－501CAR－T基于小鼠CD19特异性单链抗体（4G7）。截至2021年4月19日，41例患者接受了ALLO－501治疗，有效人群包括32例患者，共三个剂量组（40， 120和360×106）。治疗包括先前的淋巴清除，包括使用氟达拉滨加环磷酰胺和ALLO－647。
结果显示，整体ORR为75％（24／32），50％（16／32）完全缓解（CR）。研究报告11例（27％）患者出现轻度至中度CRS，1例（2％）出现3级神经毒性，登记患者中无GvHD。感染率为61％（25／41），与使用自体CAR－T细胞的试验中观察到的感染率相似。
UCART19抗CD19CAR－T细胞
UCART19是一种基于慢病毒转导CAR19并使用TRAC／CD52特异性TALENs的CAR－T细胞产品。TALENs用于在编码TCR和CD52α恒定链的基因中引入KOs，以最小化GvHD风险。用磁珠去除残留的TCR＋细胞后，只有0．7％的细胞具有可检测的细胞表面TCR。
在7名儿童的PALL试验和14名成人的CALM试验中，评估了UCART19的安全性和有效性。患者必须有CD19＋B细胞急性淋巴细胞白血病的证据，在UCART19输注前，所有患者均进行了淋巴清除：17名患者（81％）给予了氟达拉滨、环磷酰胺和alemtuzumab，4名患者（19％）给予了氟达拉滨和环磷酰胺。
PALL试验中的儿童接受UCART19（1．1–2．3×106／kg），CALM试验包括剂量递增阶段（6×106细胞、6–8×107细胞或1．8–2．4×108细胞）。全体患者和接受含alemtuzumab的淋巴清除患者的ORR分别为67％（14／21）和82％（14／17）。14名患者中有10名（71％）获得完全缓解，并继续进行异基因造血干细胞移植（HSCT）。研究报告，在2019年8月的数据截止日期，14名获得响应的患者中有10名（71％）随后复发或死亡。6个月时无进展生存率为27％。
UCART19观察到的副作用似乎与报道的自体抗D19 CAR－T细胞的副作用相似。CRS是UCART19治疗最常见的不良事件（91％的患者），等级≥3的CRS出现在三名患者中。只有两名患者（10％）在UCART19输注后出现1级GvHD。
CTX110抗CD19CAR－T细胞（NCT04035434）
UCART19和其他CAR－T细胞使用随机整合的病毒将编码CAR结构的基因传递给T细胞DNA。CRISPR Therapeutics使用CRISPR／Cas9将CAR结构精确插入TRAC位点。CTX110是使用该技术靶向CD19＋B细胞恶性肿瘤的CAR－T细胞。
目前，正在进行的1期CARBON临床试验评估了CTX110在11例患有r／r NHL患者中的安全性和有效性。11名患者在使用氟达拉滨和环磷酰胺进行淋巴细胞清除后，以四种剂量水平（30、100、300或600×106）输注CTX110细胞。
结果显示，在30–300×106 剂量组中，没报告有GvHD病例。其它不良反应包括3例等级≤2的CRS（30％）和1例2级ICAN（10％）。36％（4／11）的患者获得CR。
PBCAR0191抗CD19CAR－T细胞（NCT03666000）
Precision BioSciences公司的同种异体产品PBCAR0191使用了基于I－CreI归巢内切酶的通用基因组编辑平台ARCUS，将CD19特异性CAR插入TRAC位点。I期临床研究的初步数据显示， 27例患者（16例为r／r NHL，11例为r／r B－ALL）中，所有剂量组的ORR和CR分别为55％（15／27）和37％（10／27）。
最近，另一项研究报告了PBCAR0191高剂量（3×106个细胞）并伴有增强淋巴清除（氟达拉滨加环磷酰胺）的患者队列的临床结果。试验共纳入21例患者，包括16例非霍奇金淋巴瘤患者和5例B－ALL患者，对其中13例NHL患者和5例ALL患者的治疗效果进行了评估。结果显示，ORR为83％（15／18），CR为66％（12／18）。大多数不良事件是轻微的，在1例NHL患者中观察到ICANS 3级，在31％（5／16）NHL患者中观察到3级感染，在80％（4／5）B－ALL患者中观察到3级感染，未观察到GvHD的证据。
CYAD－101（NCT03692429）
CYAD－101是由Celyad Oncology开发的一款基于NKG2D受体和TCR抑制分子（TIM）的非基因编辑同种异体CAR－T细胞。NKG2D受体可以识别表达在大多数实体瘤和血癌细胞表面的8种不同的配体，使其可以同时靶向多种不同的癌症；TIM旨在消除负责GvHD的免疫反应，从而避免GvHD。
CYAD－101在不可切除转移性结直肠癌患者的alloSHRINK I期研究中进行了评估。在标准预处理化疗（FOLFOX）后，15名患者接受三种剂量水平中的一种（每次输注1×108、3×108或1×109细胞）。研究没有报告剂量限制性毒性或GvHD。在15名患者中，2名（13％）患者获得部分缓解（PR），9名（60％）患者病情稳定（SD）。
CIK抗CD19细胞（NCT03389035）
有研究提出了一种基于“睡美人”转座子系统的异基因CAR－T细胞，用CARs产生CIK细胞。根据CIK细胞方案，刺激细胞分化为记忆T细胞亚群。在多中心临床研究中（NCT03389035），对13例HSCT后复发的B－ALL患者使用CARCIK－CD19细胞。研究没有报告ICANS或GvHD病例，唯一的严重不良事件是接受最高剂量治疗患者出现的两例1级和2级CRS。61．5％的患者出现完全缓解，而在接受两种最高剂量的6名患者中，85．7％的患者出现完全缓解。
ATA188（NCT03283826）
ATA188是一款由Atara公司开发的异基因EBV特异性T细胞免疫疗法。在针对多发性硬化症的的I期试验中评估了ATA188这种EBV特异性T细胞亚群的初步疗效和安全性。结果显示，在输注ATA188细胞后无GvHD或CRS的记录，进行性多发性硬化症患者对ATA188耐受性良好，未见剂量限制性毒性。
Vγ9Vδ2 T细胞
异基因Vγ9Vδ2 T细胞治疗在晚期恶性肝癌（NCT03183232）、肺癌（NCT03183219）、胰腺癌（NCT03183206）或乳腺癌（NCT03180437）中进行了临床评估。输注异基因Vγ9Vδ2 T细胞后未报告重大不良事件（CRS、GvHD）。
NK细胞
关于工程化异基因CAR－NK细胞，有研究报告了一期和二期试验的结果，其中11名r／r NHL或CLL患者接受了来自脐血的HLA不匹配的抗CD19 CAR－NK细胞治疗。研究没有报告CRS、ICAN和GvHD，所有患者都有可逆的血液毒性事件，主要与淋巴细胞清除有关。在平均13．8个月的随访中，7名患者（64％）完全缓解。
在唯一完成的针对AML患者靶向CD33的CAR－NK－92试验中，在输注CD33－CAR NK－92细胞后仅有两例I级CRS，无GvHD病例。然而，不幸的是，两名患者复发，一名患者对治疗无反应。
小结
显然，使用来自健康捐赠者的CAR－T细胞产品是有利的，因为它对患者的免疫状态依赖性较小，更标准化，并且由于生产成本较低，大大扩大了患者获得治疗的机会。此外，还必须考虑到，在疾病迅速发展时，自体CAR－T细胞制造所需的时间是一个关键因素；另外，一小部分患者可能永远无法获得数量、质量良好的自体CAR－T细胞。
然而，异基因CAR－T细胞可能导致GvHD，并且自身可能被受体的免疫系统排斥。此外，与自体CAR－T细胞相比，同种异体CAR－T细胞的疗效和应答率较低，这在很大程度上归因于其较低的持久性。但从长远来看，这也可能是一种安全优势。
目前，多项研究正在临床中检验不同靶点和不同技术平台开发的异基因CAR－T细胞疗法，随着现有技术的进一步成熟和新技术的开发，相信异基因CAR－T细胞疗法终将会使更多的肿瘤患者受益。
参考文献：
1．Strategies to Circumvent the Side－Effectsof Immunotherapy Using Allogeneic CAR－T Cells and Boost Its Efficacy： Resultsof Recent Clinical Trials． Front Immunol． 2021； 12： 780145．
